Functional study of voltage-gated sodium channels Nav1.1 and Nav1.2 mutations : phenotype/genotype relationship and highlighting of a specific mechanism for Autism Spectrum Disorder
Étude fonctionnelle de mutations des canaux sodiques potentiel-dépendants Nav1.1 et Nav1.2 : corrélation phénotype/génotype et mise en évidence d’un mécanisme spécifique pour les troubles du spectre de l’autisme
Résumé
The genes encoding for the voltage-gated sodium channels (Nav) expressed in the central nervous system are the target of numerous mutations leading to various phenotypes. The aim of my work is to understand why mutations in the same gene can lead to distinct pathologies in order to consider the development of new therapeutic approaches. The SCN1A gene encoding for the Nav1.1 channels, mainly expressed in GABAergic interneurons (GABA IN), is the target of mutations responsible for epileptic syndromes and familial hemiplegic migraine (FHM-3), a rare form of migraine with aura. The mutations responsible for epilepsy have been shown to cause a loss of function, which leads to hypoexcitability of GABA IN and subsequently to the network hyperexcitability. At the opposite, the mutations responsible for MHF-3 showed a gain of function and hyperexcitability of GABA IN which can lead to the cortical spreading depression, a pathological mechanism of migarine. In particular, the functional study of the L1649Q mutation showed that the mutation leads to an important decrease of the current density (loss of function). Analysis of the biophysical properties of the mutated channels after partial recovery of the current density showed that the overall effect of the mutation is a gain of function, consistent with an hyperexcitability of GABA IN (Cestele and al. 2013 PNAS). In order to identify if other FHM-3 mutations share the same mechanism (loss / gain of function), the first part of my thesis aimed to characterize a new mutation responsible for MHF-3, L1670W. This mutation leads to a defect in the Nav1.1 channels expression at the membrane but after partial recovery of the current density, the mutation induces a clear gain of function of Nav1.1 channels. These results showed that the L1670W mutation, like the L1649Q mutation, leads to a defect in the Nav1.1 channels expression at the membrane and a gain in function, thus reinforcing the hypothesis that this mechanism could be generalized to other mutations responsible for MHF-3. The SCN2A gene encodes for the α subunit of Nav1.2 channels mainly expressed in excitatory neurons. Mutations in the SCN2A gene are responsible for different pathologies such as benign epilepsies, epileptic encephalopathies and autism spectrum disorder (ASD). To date, the detailed mechanisms responsible for these different pathologies remain unclear. In order to elucidate the genotype/phenotype relationship, we studied the functional effects of 23 SCN2A mutants responsible for these different pathologies. Our results show that all the mutations responsible for ASD induce an important decrease (almost complete) of the current density while for the other pathologies the effects are heterogeneous. In order to reproduce the heterozygous conditions, we studied the co-expression of wild-type (WT) channels with each mutated channel. Our results showed a reduction in the WT channels current density only in the presence of channels carrying mutations responsible for ASD. Consequently, only the mutations responsible for ASD induce a negative dominance on WT channels. To determine whether this negative dominance mechanism is due to the interaction of α subunits described recently (Clatot et al., 2018 Nat Commun), we used different strategies to inhibit this interaction. The results obtained showed that the negative dominance effect of the mutants responsible for ASD is no longer observed when the interaction between the α subunits is inhibited. Therefore, our results allow us to describe for the first time that mutations in Na+ channels responsible for ASD act by a negative dominance mechanism, which is mediated by the interaction between WT and mutated channels.
Les gènes codant pour les canaux sodiques potentiel-dépendants (Nav) présents dans le système nerveux central sont la cible de mutations conduisant à divers phénotypes. L’objectif de mon travail de thèse est de comprendre pourquoi des mutations d’un même gène peuvent conduire à des pathologies distinctes afin d’envisager le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le gène SCN1A codant pour le canal Nav1.1, exprimé principalement dans les interneurones GABAergiques (IN GABA), est la cible de mutations responsables de syndromes épileptiques et de la migraine hémiplégique familiale (MHF-3), une forme rare de migraine avec aura. Il a été montré que les mutations responsables de l’épilepsie induisent une perte de fonction du canal, ce qui conduit à une hypoexcitabilité des IN GABA dont résulte une hyperexcitabilité du réseau neuronal. L’analyse fonctionnelle de mutations responsables de la MHF-3 a montré qu’elles induisent un gain de fonction du canal et une hyperexcitabilité des IN GABA pouvant être à l’origine d’une dépression corticale envahissante, un mécanisme pathologique de la migraine. En particulier, l’étude de la mutation L1649Q a montré qu’elle induit une réduction importante de la densité de courant des canaux Nav1.1 (défaut d’expression des canaux). L’analyse des propriétés biophysiques des canaux mutés après récupération de la densité de courant a mis en évidence que l’effet de la mutation correspond à un gain de fonction allant dans le sens d’une hyperexcitabilité des IN GABA (Cestèle et al.2013 PNAS). Afin d’identifier si d’autres mutations MHF-3 possèdent le même mécanisme (perte/gain de fonction), la 1ère partie de ma thèse a consisté en la caractérisation fonctionnelle d’une nouvelle mutation responsable de la MHF-3, L1670W. Cette mutation conduit à un défaut d’expression des canaux Nav1.1 (perte de fonction) cependant, après récupération de la densité de courant, la mutation induit un gain de fonction des canaux Nav1.1. Ces résultats ont permis de mettre en évidence que la mutation L1670W induit un défaut d’expression des canaux à la membrane et un gain de fonction renforçant ainsi l’hypothèse selon laquelle ce mécanisme pourrait être généralisé à d’autres mutations MHF-3. Le gène SCN2A codant pour le canal Nav1.2, exprimé principalement dans les neurones excitateurs, est la cible de mutations responsables de différentes pathologies telles que les épilepsies bénignes, les encéphalopathies épileptiques et les troubles du spectre de l’autisme (TSA). A ce jour, les mécanismes responsables de ces pathologies restent flous. Dans le but d’élucider la relation génotype/phénotype, nous avons étudié les effets fonctionnels de 23 mutants SCN2A responsables de ces différentes pathologies. Nos résultats montrent que toutes les mutations responsables de TSA induisent une perte presque totale de densité de courant tandis que pour les autres pathologies les effets sont hétérogènes. Dans le but de reproduire les conditions hétérozygotes, nous avons étudié la co-expression des canaux wild-type (WT) avec chaque canal muté. Nos résultats ont mis en évidence une réduction de la densité de courant des canaux WT uniquement en présence de canaux porteurs de mutations responsables de TSA. Par conséquent, seules les mutations responsables de TSA induisent un phénomène de dominance négative sur les canaux WT. Afin de déterminer si ce mécanisme de dominance négative est dû à l’interaction de 2 sous-unités α décrite récemment (Clatot et coll., 2018 Nat Commun), nous avons utilisé différentes stratégies pour inhiber cette interaction. Les résultats obtenus ont montré que l'effet de dominance négative des mutants responsables de TSA n’est plus observé lorsque α-α est inhibée. Par conséquent, nos résultats permettent de décrire pour la 1ère fois que les mutations des canaux Na+ responsables de TSA agissent par un mécanisme de dominance négative, lequel est médié par l’interaction entre les canaux WT et mutés.
Origine : Version validée par le jury (STAR)