Role of Otx2 in mature retinal photoreceptors - Université Côte d'Azur Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2019

Role of Otx2 in mature retinal photoreceptors

Rôle d'Otx2 dans les photorécepteurs de la rétine mature

Résumé

Although the role of Otx2 transcription factor in retinal development is well understood, its function in the adult retina remains unclear. Otx2 expression is maintained in Retinal Pigmented Epithelium (RPE), photoreceptors (PRs) and bipolar cells throughout life. Previous works from our lab showed that Otx2 ablation in the adult retina leads to photoreceptor degeneration, suggesting a role in their maintenance. It was then showed that RPE-restricted Otx2 expression was both necessary and sufficient for photoreceptor maintenance, indicating a non-cell-autonomous neuroprotective function. This left unexplained the function of endogenous Otx2 in PRs. In order to elucidate it, we performed PR-specific Otx2 knockout, using the inducible PR-specific Crx-CreERT2 mouse line. Histology confirmed that endogenous Otx2 is not required for PR survival or maintenance of their cell identity in the adult. However, we found that Otx2 is implicated in visual adaptation, by regulating the light induced movement of arrestin in photoreceptors. Arrestin shuttles between PR outer segments, where it accumulates in the light, and inner segments and soma, where it accumulates in the dark, to modulate PR sensitivity, in response to different light intensities. Such trafficking is compromised in PR-specific Otx2 KO mice, where arrestin remains blocked in inner segments and soma, even after prolonged light exposure. Behavioural tests showed that PR-specific Otx2 KO mice are strongly photophobic. The detailed mechanisms remain to be elucidated.To decipher the genetic network controlled by Otx2 in PRs, we carried out time series RNA-seq analyses following PR-specific Otx2 knockout. No photo-transduction gene was found to be deregulated. Instead of that, we found down-regulation of extracellular matrix genes and, surprisingly, of a group of RPE-specific genes involved in melanogenesis, genes that were already known to be direct targets of Otx2. Careful examination of PR-specific Otx2 KO mice confirmed that Otx2 protein level in the RPE nuclei was reduced while some Otx2protein could now be detected in PR outer segments. According to such data and to the neuroprotective effect of RPE-restricted Otx2, we hypothesized a direct Otx2 protein transfer from RPE to PRs. To prove this hypothesis, viral vectors driving tagged-Otx2 expression specifically in RPE cells were generated and used for sub-retinal injection in mice. After RPE transduction, tagged-Otx2 could be detected in the PRs. We found that in wild type retina, constitutive Otx2 transfer is active at low rate. After KO induction in the PRs, the transfer rate is increased, probably acting as a neuroprotective response. Such increment in the transfer explains well the reduction of Otx2 protein level in the RPE and the subsequent downregulation of melanogenesis genes. Transferred Otx2 appears to travel across PR cells from the inner and outer segments to the synapse in the outer plexiform layer, suggesting its neuroprotective function involves mechanisms that are different from its classical genomic function of transcription factor.In conclusion, this study disclosed a new function of endogenous Otx2 in PR light adaptation and demonstrated the existence of a transfer of Otx2 from RPE to PR cells, with a putative neuroprotective role.
Si le rôle du facteur de transcription Otx2 dans le développement de la rétine est bien compris, sa fonction dans la rétine adulte reste floue. L'expression d’Otx2 est maintenue dans l'épithélium pigmenté rétinien (RPE), les photorécepteurs (PR) et les cellules bipolaires durant toute la vie. Des travaux antérieurs ont montré que l’ablation du gène Otx2 dans la rétine adulte conduit à une dégénérescence des PR, suggérant qu’il a un rôle dans leur maintenance. Il a ensuite été montré que l’expression d’Otx2 restreinte dans le RPE est à la fois nécessaire et suffisante pour la survie des photorécepteurs, ce qui indique une fonction neuroprotectrice non autonome dans ces cellules. Ces résultats n’expliquent pas la fonction de la protéine Otx2 endogène dans les PR. Afin de l'élucider, nous avons utilisé la lignée de souris Crx-CreERT2 inductible pour procéder à la délétion du gène Otx2 spécifiquement dans les PR. L'histologie a confirmé que l’expression d’Otx2 endogène n'est pas nécessaire à la survie des PR ni au maintien de leur identité cellulaire chez l'adulte. Cependant, nous avons constaté qu’Otx2 est impliqué dans l'adaptation visuelle en régulant le mouvement de l'arrestine induit par la lumière, dans les photorécepteurs. L’arrestine est transportée entre les segments externes du PR, où il s'accumule à la lumière, et les segments internes et le soma, où il s'accumule dans l'obscurité, pour moduler la sensibilité du PR, en réponse à différentes intensités lumineuses. Ce trafic est compromis après délétion d’Otx2 dans les PR : l’arrestine reste bloquée dans les segments internes et dans le soma, même après une exposition prolongée à la lumière. Des tests comportementaux ont montré que les souris mutantes sont fortement photophobes. Les mécanismes détaillés restent à élucider.Pour déchiffrer le réseau de gènes contrôlé par Otx2 dans les PR, nous avons effectué des analyses temporelles par RNA-seq au décours de l'inactivation d’Otx2 dans les PR. Aucun gène de la cascade de phototransduction ne semble dérégulé. Par contre, l’expression de certains gènes de la matrice extracellulaire et, de manière surprenante, d'un groupe de gènes spécifiquement impliqués dans la mélanogénèse dans le RPE, et déjà connus pour être des cibles directes d'Otx2, est diminuée. Un examen attentif des souris porteuses d’une délétion d’Otx2 spécifique dans les PR a confirmé que le niveau de protéine Otx2 dans les noyaux du RPE est réduit, tandis que la protéine Otx2 peut maintenant être détectée dans les segments externes de PR. Au vu de ces données et de l'effet neuro-protecteur d'Otx2 joué par le RPE, nous avons émis l'hypothèse d'un transfert direct de la protéine Otx2 du RPE aux PR. Pour prouver cette hypothèse, des vecteurs viraux dirigeant l'expression d’une forme d’Otx2 étiquetée, spécifiquement dans les cellules du RPE, ont été générés et utilisés pour l'injection sous-rétinienne chez la souris. Après transduction du RPE, nous avons recherché si la forme d’Otx2 étiquetée pouvait être détectée dans les PR. Nous avons constaté que dans la rétine contrôle, un transfert constitutif d'Otx2 est actif à faible débit. Après l'induction du KO dans les PR, le taux de ce transfert est augmenté, agissant probablement comme une réponse neuro-protectrice. Une telle augmentation du transfert explique bien la réduction du taux de protéine Otx2 dans le RPE et la diminution d’expression des gènes de la mélanogenèse. La protéine Otx2 transférée semble être transportée des segments externe et interne des PR vers les synapses situées dans la couche plexiforme externe, ce qui suggère que sa fonction neuro-protectrice met en jeu des mécanismes différents de sa fonction génomique classique de facteur de transcription.En conclusion, cette étude a révélé une nouvelle fonction de la protéine Otx2 endogène dans l'adaptation des PR à la lumière et a démontré l'existence d'un transfert de protéine Otx2 exogène, du RPE vers les PR, avec un rôle neuro-protecteur présumé.
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  • HAL Id : tel-02943014 , version 1

Citer

Pasquale Pensieri. Role of Otx2 in mature retinal photoreceptors. Molecular biology. COMUE Université Côte d'Azur (2015 - 2019), 2019. English. ⟨NNT : 2019AZUR6038⟩. ⟨tel-02943014⟩
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